3D細胞培養--子宮內膜基質細胞eSCs和腫瘤血管內皮細胞

Eph和ephrin蛋白在協調細胞、細胞導向、細胞與細胞之間的相互作用中發揮著非常重要的作用，與發展的組織模式和器官和血管生成都有關系。Eph家族成員在人類腫瘤的發展過程中有著非常關鍵功能，在正常的子宮內膜的血管化再生組織和人子宮內膜具有多向分化潛能的間充質干細胞（EMSC）有能檢測到Eph家族的蛋白表達，而其他高度血管化的人體器官卻沒有Eph的表達。澳大利亞的科學家發現，將EphA3+ or EphA3-depleted eSCs和tumour-derived endothelial cells (TECs)共培養時，EphA3+ eSCs不僅有更多的大細胞簇（15個細胞以上組成的）并且有更多的細胞簇。在添加 IIIA4這種Eph活化劑的時候，EphA3+ eSCs的細胞簇的數量有顯著的降低。

Hypoxia-Controlled EphA3 Marks a Human Endometrium-Derived Multipotent Mesenchymal Stromal Cell that Supports Vascular Growth

C. To, R. Farnsworth, M. Vail, C. Chheang, C. Gargett, C. Murone, C. Llerena, A. Major, A. Scott and P. Janes

PloS one, 2014, 10.1371/journal.pone.0112106

（一）實驗材料和實驗方法

1）細胞：  EphA3+eMSCs                                 6 ×103cell/well

           EphA3-eSCs                                    6 ×103cell/well

           tumour-derived endothelial cells (TECs)         1.2 ×104cell/well

2）試劑：  5 mg/ml Alexa647 human/mouse chimeric (ch)IIIA4 antibody 

           Alexa647 human Fc as control （Jackson ImmunoResearch)

           5 mg/ml EphA3-Fc

           4% PFA/0.2% glutaraldehyde

           DAPI

3）基質膠：    Matrigel (ECMatrix, Millipore)                  10 µl per well

4）耗材：      µ-Slide Angiogenesis, ibiTreat (ibidi, 81506) 

5）儀器：      AF6000 LX microscope (Leica)    10x tile scan imaging 

6）其他：      細格紙                                             1 sheet 

1. 實驗步驟

1. 準備基質膠

1. 實驗前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使膠能過第二天緩慢融化。（注意：同樣要準備一些4。C預冷的槍頭用于吸取Matrigel）

1. 開始實驗前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。
2. 打開滅菌包裝，取出ibidi血光生成載玻片 µ-Slide Angiogenesis。

1. 每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經上孔而留下殘留膠。

怎么知道加了合適體積的Matrigel：

由于Matrigel流動性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會影響到實驗的成像結果。這時用一張格子紙就能知道移液槍調整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態。

1. 凝膠

1. 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
2. 準備一個10cm的培養皿，放入浸過水的紙巾，制成一個濕盒。
3. 將ibidi血管生成載玻片放入培養皿中，蓋上培養皿蓋。
4. 將整個培養皿放入培養箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結。
5. 等待同時準備細胞懸液。

1. 鋪細胞

• 按照1:2的比例準備EphA3+eMSCs或EphA3-eSCs與tumour-derived endothelial cells (TECs)混合的細胞懸液（6 ×103cell/well：1.2 ×104cell/well）
• 將膠已經凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
• 每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。
• 蓋上蓋，靜置，一段時間后，所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

1. 不同培養基處理

采用5 mg/ml Alexa647-IIIA4 antibody或Alexa647-Fc 或5 mg/ml EphA3-Fc或培養基分別加入血管生成載玻片中，37℃，培養多于18小時。

1. 采集圖像并統計結果

采集圖像并且統計細胞簇個數和細胞簇內細胞的個數。

1. 實驗結果

如圖所示，EphA3+ eMSCs細胞簇比EphA3-eSCs細胞簇更大，更多，并且內含15個細胞的細胞簇也越多。

當添加X-lkd IIIA4后，EphA3+ eMSCs細胞簇中大型細胞簇的比例有顯著的下降。